ÉTUDE DU RÔLE DU GÈNE Nodal AU COURS DU DÉVELOPPEMENT PRÉIMPLANTATOIRE

 

L’expression de Nodal est détectée pour la première fois dans la masse cellulaire interne (MCI) du blastocyste au jour embryonnaire 3,5 (E3.5) (Granier et al., 2011 ; Takaoka et al., 2006 ; Takaoka et al., 2017). À E3.75, lorsque la MCI donne naissance à l’épiblaste pluripotent (Epi) et à l’endoderme primitif (PrE), un tissu extra-embryonnaire, l’expression de Nodal persiste dans l’Epi mais devient plus forte dans les cellules du PrE. A E4.5, lorsque l’embryon s’implante, l’expression de Nodal est diminuée dans le PrE mais augmente dans l’Epi. On a constaté que l’activité de la voie de signalisation ACTIVINE/NODAL à ces stades suit de près l’expression de Nodal (Granier et al., 2011).

Le défaut le plus précoce décrit chez les embryons Nodal^-/- jusqu’à présent est leur incapacité à activer l’expression de Lefty1, un antagoniste de NODAL qui est également une cible de sa voie de signalisation, dans les cellules de la MCI et du PrE entre E3.5 et E4.5 (Takaoka et al., 2017). Les embryons E4,5 Nodal^-/- comprennent néanmoins les trois couches cellulaires qui constituent normalement un blastocyste en cours d’implantation. Ce n’est qu’après l’implantation que leurs défauts de développement caractéristiques, l’incapacité à établir des identités cellulaires embryonnaires et extra-embryonnaires spécifiques, à établir un axe AP et à gastruler, ont été caractérisés (Robertson 2014). Outre Lefty1, d’autres cibles possibles de NODAL aux stades préimplantatoires ont été identifiées dans des études sur les cellules souches embryonnaires (ESCs), qui sont représentatives des cellules Epi précoces (Galvin et al., 2010; Mullen et al., 2011). Compte tenu de la prééminence de certaines de ces cibles, qui comprennent des facteurs de transcription et des composants des voies de signalisation, l’absence d’un phénotype préimplantatoire peut sembler surprenante. Une raison possible de cette absence apparente de défauts précoces est la présence à ces stades de ligands d’origine zygotique (ACTIVINE) et utérine (ACTIVINE, NODAL) susceptibles de compenser l’absence de NODAL zygotique (Papanayotou & Collignon, 2014). Le fait que la signalisation ACTIVINE/NODAL est active dans l’embryon bien avant que l’expression de Nodal zygotique ne commence, est en accord avec cette possibilité (James et al., 2005).

Afin de révéler les contributions respectives de NODAL et d’ACTIVINE à la formation du blastocyste nous réalisons donc actuellement une comparaison des phénotypes d’embryons exposés à divers traitements inducteurs ou inhibiteurs avec ceux d’embryons Nodal^-/- fraîchement disséqués ou cultivés ex-utero.

Ce programme a été soutenu par le programme Émergence (IDEX Université Paris Cité), la Fondation ARC, l’École Doctorale BioSPC et l’EUR G.E.N.E.

 

ETUDE DU MÉCANISME DE LA RÉGIONALISATION DE LA LIGNE PRIMITIVE

 

Nous cherchons à comprendre comment la ligne primitive (LP), dont la formation marque le début de la gastrulation, est régionalisée chez l’embryon de souris. La LP apparaît au sein de l’épiblaste proximal postérieur, et s’étend progressivement vers son extrémité distale. Les cellules émergeant précocement de la région proximale/postérieure de la LP vont migrer de manière proximale pour former le mésoderme extra-embryonnaire ou de manière latérale pour former le mésoderme embryonnaire, tandis que les cellules émergeant de sa région distale/antérieure vont former le mésoderme axial et l’endoderme définitif. Des mutations de perte de fonction complètes et partielles ont montré que trois protéines sécrétées, WNT3, BMP4 et NODAL, sont essentielles à la formation et à la régionalisation de la LP. Ces études ont abouti à un modèle dans lequel des gradients opposés de signalisation de NODAL et de BMP4 régissent l’allocation des destins cellulaires de la LP, la signalisation BMP la plus élevée favorisant le mésoderme extra-embryonnaire dans la LP postérieure, et la signalisation NODAL la plus élevée favorisant l’endoderme définitif dans la LP antérieure (Tam et al., 2006 ; Arnold & Robertson 2007).  S’il y a bien des indications qu’un tel gradient de signalisation BMP existe (Yamamoto et al., 2009), c’est beaucoup moins clair pour la signalisation NODAL (Camacho-Aguilar & Warmflash, 2020). Des résultats obtenus chez le poisson zèbre suggèrent qu’une longue exposition à la signalisation NODAL favorise effectivement les destins LP antérieurs (Hill, 2018), mais dans l’embryon de souris, il a été difficile d’établir un lien entre exposition au ligand et destin cellulaire. En outre, l’interdépendance des expressions de Wnt3, Bmp4 et Nodal, et leurs rôles dans la régionalisation de l’embryon à des stades plus précoces rendent difficile de séparer, par exemple, l’effet du manque de NODAL de ceux d’un manque de BMP4 ou de WNT3 dans les défauts de régionalisation des embryons Nodal^-/-. Enfin, la faible quantité de matériel biologique dans un embryon rend difficile l’application de méthodes biochimiques pour étudier comment les décisions relatives à la détermination de l’identité cellulaire intègrent ces 3 signaux. Cependant, le développement récent de méthodes qui utilisent des cellules pluripotentes pour récapituler la gastrulation in vitro, permettant ainsi un meilleur contrôle des conditions dans lesquelles la régionalisation a lieu, rend maintenant possibles ces investigations.

Afin de comparer les événements qui se déroulent in vitro avec ceux qui se déroulent réellement dans l’embryon de souris, notre collaborateur Benoit Sorre (UMR168 Institut Curie/CNRS) a adapté une méthode qu’il avait initialement développée avec des cellules souches embryonnaires humaines (hESCs) (Warmflash et al., 2014) à l’utilisation de cellules souches pluripotentes de souris représentatives de l’épiblaste pré-gastrulation, les EpiLCs (Plouhinec et al., 2021). Ce modèle in vitro de gastrulation en 2D, ou gastruloïde 2D de souris (m2DGas), présente de nombreux avantages. Il est simple à mettre en oeuvre, plusieurs colonies peuvent être générées en même temps, et il se prête à l’imagerie et à la quantification. Nous avons constaté, comme d’autres (Morgani et al., 2018), que les m2DGas, s’auto-organisent de manière reproductible lorsqu’ils sont exposés à BMP4, formant en 48H une LP qui donne ensuite naissance à un anneau de cellules mésodermiques entourant un noyau d’ectoderme. Nous utilisons maintenant un ensemble d’approches (Immunofluorescence, hybridation in situ, RT-qPCR, RNAseq en cellules uniques, inférence de réseaux de régulation, essai de ligature de proximité) pour étudier dans ce modèle le mécanisme qui sous-tend la régionalisation de la LP.

Ce projet a été soutenu par l’INCa et l’École Doctorale BioSPC.  Il est actuellement soutenu par la Ligue Contre le Cancer et par l’ANR.

 

Colonie EpiLC de 500  mm de diamètre après stimulation BMP4 pendant 36h. A gauche, le marquage des noyaux au Hoechst (bleu) permet de visualiser l’ensemble des cellules, à droite le marquage par immunofluorescence permet d’identifier les cellules de la ligne primitive et du mésoderme naissant (BRA en rouge), du mésoderme extra-embryonnaires (CDX2 en vert) et de la ligne primitive proximale (FOXA2 en cyan).

 

ÉTUDE DU RÔLE DU GÈNE LADON, ANTISENS DE NODAL, DANS LA PROGRESSION TUMORALE DU MÉLANOME HUMAIN

 

L’implication de NODAL dans la progression tumorale et les métastases a été décrite pour la première fois dans des lignées cellulaires de mélanome (Topczewska et al., 2006). Cependant, alors que des preuves soutenant un tel rôle pour ce ligand ont été obtenues dans d’autres types de cancer, sa contribution réelle à la formation de métastases dans le mélanome a été contestée (Donovan et al., 2017; Hooijkaas et al., 2011), notamment parce que son expression n’était pas toujours détectée. Une revue des données disponibles sur l’expression de NODAL dans les cellules cancéreuses a suggéré l’existence de variants d’épissage (Strizzi et al., 2012), incluant tous le deuxième exon du gène mais dépourvus parfois, notamment dans les lignées cellulaires de mélanome, de son troisième (et dernier) exon et donc de la capacité à produire un ligand fonctionnel. Cette observation fournit une explication aux différences constatées entre les niveaux d’expression de NODAL rapportés par différentes études pour ces lignées cellulaires, mais soulève également la possibilité d’une fonction du gène indépendante de la protéine qu’il encode.

Nous avons donc utilisé l’édition du génome pour supprimer l’exon2 de NODAL dans la lignée cellulaire de mélanome A375, un modèle cellulaire reconnu de mélanome humain précédemment décrit comme exprimant NODAL (Topczewska et al., 2006). Cette mutation a réduit de manière drastique la capacité de ces cellules à acquérir un phénotype invasif. Cependant, l’inhibition ou la stimulation exogène de la signalisation ACTIVINE/NODAL n’a eu aucun effet sur le comportement des cellules A375, et nous n’avons pas pu détecter l’expression de NODAL dans ces cellules, ce qui implique que ni le ligand NODAL ni son ARNm ne jouent un rôle dans ce phénotype. Nous avons cependant découvert que la mutation désactivait l’expression d’un transcrit antisens naturel de 1750 nucléotides de long, chevauchant l’exon2 entier de NODAL (Fig.1). Identifié à l’origine dans le glioblastome, il était jusqu’à présent passé largement inaperçu. Nous avons appelé ce transcrit LADON et confirmé qu’il s’agit bien de ce que des études antérieures avaient identifié par erreur comme étant l’expression de NODAL dans les lignées cellulaires de mélanome, ainsi que dans certaines autres lignées cellulaires cancéreuses. L’expression forcée de LADON dans des cellules A375 mutantes pour l’exon2 de NODAL a permis de sauver les défauts constatés dans ces cellules, et a donc confirmé son implication dans l’acquisition d’un comportement invasif.

Il existe de multiples exemples de l’implication des longs ARN non codants (lncRNA) dans la physiologie des tissus et dans la dérégulation des processus cellulaires qui aboutissent au cancer (Huarte 2015 ; Iyer et al., 2015 ; Schmitt & Chang). C’est la raison de l’intérêt que suscitent actuellement les lncRNA en tant que biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic, mais aussi en tant que cibles potentielles pour la thérapie ou en tant qu’outils pour corriger l’expression génique défectueuse qui sous-tend le cancer et d’autres pathologies (Wahlestedt 2013 ; Slaby et al., 2017). Bien que nous ayons caractérisé certains des événements qui dépendent de l’expression de LADON dans les cellules de mélanome, nous ne savons pas comment il les déclenche réellement. Nos objectifs sont donc d’identifier les cibles directes de LADON et de caractériser la manière dont il contrôle leur expression.

Ce projet a été soutenu par l’INCa et le GEFLUC.

 

Cellules de mélanome de la lignée A375, dont l’acquisition d’un comportement invasif dépend de l’expression du transcrit LADON. Les noyaux sont en bleu et le cytosquelette en rouge.

Responsable :

Jérôme COLLIGNON
Téléphone : +33 (0)157278108
jerome.collignon(at)ijm.fr

 

Membres de l’équipe :

DUTRIAUX Annie, IE U. Paris Cité, annie.dutriaux(at)ijm.fr, 01 57 27 81 10

FLAGIELLO Domenico, MCU U. Paris Cité, domenico.flagiello(at)ijm.fr, 01 57 27 80 86

GATTOBIGIO Futura, Doctorante, futura.gattobigio(at)ijm.fr, 01 57 27 81 09

SIMON Gaël, Doctorant, gael.simon(at)ijm.fr, 01 57 27 81 09

JANNAT Taslimun, Master 2

Futura Gattobigio (en cours) – Université Paris Cité

Mechanism and role of NODAL signalling at preimplantation stages

 

Giulia Tomaino (2024) – University of Milano-Bicocca (cotutelle/Dept of Biotechnology and Biosciences)

Leveraging recombinant Vault nanoparticles produced in Komagataella phaffii for targeted delivery of siRNAs as therapeutic molecules

 

Gaël Simon (2023) – Université Paris Cité

In vitro study of BMP, WNT and NODAL signalling pathways during primitive streak formation and specification using mouse 2D Gastruloids

 

Nicolas Porchet (2019) – Université de Paris

Role of signaling pathways in cell-fate specification in the early mouse embryo

 

Mathieu Vieira (2018) – Université Paris Diderot

Régulation de l’expression du gène Nodal lors de la différenciation des cellules souches embryonnaires

 

Marieke Cajal (2013) – Université Paris Diderot

Étude des étapes précoces de la formation et de la régionalisation du cerveau des vertébrés : Un rôle conservé des cellules de l’ectoderme non-neural chez la souris et le poulet

 

Elsa Mazari (2013) – Université Paris Sud (cotutelle/Laboratoire de Photonique et de Nanostructures, LPN-CNRS, Marcoussis)

Microsystèmes magnétiques et électriques pour la modification spatio-temporelle de voies de signalisation biologiques

 

Vasily Gurchenkov (2009) – Université Pierre et Marie Curie

Functional study of the asymmetric specific element of the Nodal gene during early mouse development

 

Céline Granier (2007) – Université Paris Diderot

Étude de la dynamique de la voie de signalisation NODAL chez l’embryon de souris aux stades péri-implantatoires

Collaborations en cours :

Gabriella MINCHIOTTI, IGB, Naples, Italie

Claire Chazaud, Institut GReD, Clermont-Ferrand, France

Jean-Léon MAITRE, Institut Curie, Paris, France

Caroline HILL, Crick Institute, Londres, Grande-Bretagne

Juliette AZIMZADEH, Institut Jacques Monod, Paris, France

Benoit SORRE, Institut Curie, Paris, France

Hervé ISAMBERT, Institut Curie, Paris, France

Sandrine CABURET, Institut Jacques Monod, Paris, France

 

Collaborations antérieures :

Frédérique DESHAYES, Institut Jacques Monod, Paris, France

Farida DJOUAD, IRMB, Montpellier, France

Shoumo BHATTACHARYA, Radcliffe Dept of Medicine, University of Oxford, Oxford, UK

Renata KOZYRAKI, Centre de Recherche des Cordeliers, Paris, France

Michel COHEN-TANNOUDJI, Institut Pasteur, Paris, France

Sophie CREUZET, Institut des Neurosciences Paris-Saclay, Université Paris-Saclay, Saclay, France

An ZWIJSEN, Dept for Human Genetics, KU Leuven, Leuven, Belgium

Susana M. CHUVA DE SOUSA LOPES, Leiden University Medical Centre, Leiden, The Netherlands

Sascha OTT, Warwick Systems Biology Centre, University of Warwick, Coventry, UK

Kirstie A. LAWSON, MRC Human Genetics Unit, University of Edinburgh, Edinburgh, UK

Georgy KOENTGES, Wolfson Institute for Biomedical Research, University College London, London, UK

Arnaud DUBOIS, Laboratoire d’Optique Physique, ESPCI, Paris, France

Sylvie MAZAN, Développement et Évolution des Vertébrés, Université Paris-Sud, Orsay, France

Bénédicte DURAND, CGMC, Université Claude Bernard Lyon-1, Villeurbanne

Christian CIBERT, Institut Jacques Monod, Paris, France

Financements en cours :

 

 

Financements antérieurs :