[trx_title type=”1″ style=”regular” align=”left” color=”#676362″ top=”inherit” bottom=”inherit” left=”inherit” right=”inherit”][trx_dropcaps style=”2″ top=”inherit” bottom=”inherit” left=”inherit” right=”inherit”]Protocole TUNEL[/trx_dropcaps][/trx_title]

 

 

Le principe de la technique de TUNEL est de révéler la présence de cassures dans l’ADN (présentes dans les cellules en apoptoses) par une réaction de polymérisation mettant de nucléotides modifiés qui sont par la suit mis en évidence via une réaction de coloration. Le kit de révélation Click-it TUNEL utilise des nucléotides EdU et une technologie identique à celle employée dans le kit destiné à visualiser la prolifération cellulaire. Aussi, pour les expériences de TUNEL, il est important de ne pas utiliser d’embryons incorporés à l‘EdU, faute de quoi toutes les cellules prolifératives apparaîtront également marquées par le TUNEL.

 

 

Jour 1

 

Décongeler PFA : 65°C

Décongeler glycine : 37°C

 

Réhydratation (grands paniers)

 

5min + agitation dans 75% MetOH / PBS Tw 0,1%

5min + agitation dans 50% MetOH / PBS Tw 0,1%

5min + agitation dans 25% MetOH / PBS Tw 0,1%

5min x2 + agitation dans PBS Tw 0,1%

Pour les régénérats : recouper en laissant 1 segment, nettoyer le tube digestif sous bino en maintenant sur glace.

 

Digestion Protéinase K (grands paniers) (sans agitation)

 

Stage	T digestion	cº stock: 20mg/mL	cº (µg/mL)
1 to 15h	30sec		100
24h	1min	125µL dans 25mL	100
36h	1min		100
48h	2min		100
72h	2min30		100
Régénétats classiques	10min	12.5µL dans 25mL	10
Régénétats tissus profonds	10min		100

 

 

5min x2 + agitation dans PBS Tw 0,1% / Glycine 2mg/mL (stock 10X) [5ml glycine + 45 ml PBS ]

20min + agitation dans PBS Tw 0,1% et PFA 4% [12 ml PAF + 36 ml PBS]

5min x5 + agitation dans PBS Tw 0,1%

Passer dans des tubes 2 ml avec du PBS Tw 0,1%

Conserver tous les tubes sauf le contrôle positif de côté.

 

Contrôle positif (directement dans les tubes 1,5mL ou 2mL)

Préparer solution de DNAse I (Roche) pour digestion de l’ADN :

 

Buffer DNAseI	25µL
DNAseI	10µL
H2O	215µL
Total	250µL

 

1h sur la glace pour laisser pénétrer l’enzyme (important)

1h à 37°C ou 25°C

Décongeler le Tdt reaction buffer (long)

Rinçage 5min x3 + agitation dans PBS Tw 0,1%

Equilibrer 10 min en Tdt reaction buffer à room T° (200 µl)

 

Réaction TdT (toujours directement dans les tubes)

 

Réaction pour 1 tube (voir protocole kit click-it TUNEL)
TdT reaction buffer	141µL
EdUTP	3µL
TdT	6µL
Volume total	150µL

 

1h sur la glace pour laisser pénétrer l’enzyme (important)

1h à 37°C

Overnight à RT sans agitation

 

Jour 2

 

Passer dans des petits paniers avec du PBS Tw 0,1%

Rinçage 5min x3 + agitation dans PBS Tw 0,1%

 

Révélation EdU

 

Ici, il est possible d’utiliser soit la révélation du kit TUNEL click-it Alexa647 (seulement deux composés à mélanger, mais en 647), soit la révélation du kit EdU click-it en choisissant le fluorochrome (Alexa 488 ou Alexa 555). Les deux kits étant fabriqués par la même entreprise et utilisant la même technologie Click-it, ils sont compatibles.

Protocole en utilisant la révélation du kit EdU :

Laisser 45min-1h à RT

Rinçage 5min x3 + agitation dans PBS Tw 0,1%

Hoechst 1H à room T° (1/1000^e)

Overnight 4ºC + agitation dans Glycérol 87%/DABCO

 

Exemples de résultats obtenus avec la technique TUNEL (Adrien)
(révélation kit Click-it EdU Alexa 555)