[trx_title type=”1″ style=”regular” align=”left” color=”#676362″ top=”inherit” bottom=”inherit” left=”inherit” right=”inherit”][trx_dropcaps style=”2″ top=”inherit” bottom=”inherit” left=”inherit” right=”inherit”]Fixation embryons / Larves de Platynereis[/trx_dropcaps][/trx_title]

 

Equipe Balavoine / Vervoort (16/1/14), Institut Jacques Monod, Paris.

 

Décongeler le stock PFA 16% à 65 °C jusqu’à redissolution complète de la PFA.

Préparer le volume requis de « Fix » PFA 4%/PBS 1x Tween 0.1% (12ml par fixation) et de « Préfix » 3ml de PFA 16 % + 6 ml de PBS 2x Tween 0,1 %

Récolter les larves en les passant sur un tamis nylon à 80 mm. Rincer 2 fois à l’eau de mer pour se débarrasser de la gangue muqueuse. Placer un parafilm sous le tamis et récupérer les larves dans 3 ml d’eau de mer dans un Falcon de 15 ml.

Ajouter 9ml de Prefix (4% PFA , PBS 1x final ).

Laisser sédimenter et jeter le surnageant (enlever le plus d’eau de mer).

Ajouter 12 ml de Fix.

Fixer pendant 2h à température ambiante ou sur la nuit à 4°C sous agitation.

Faire 1 rinçage de PBS 1x Tween 0,1% pdt 5 min sous agitation

Faire 1 rinçage de 50% MeOH/ 50%PBS 1x/ Tween 0,1 % pdt 15 min sous agitation

Faire 1 rinçage de MEOH 100 pdt 1 heure (ou à 4°c sur la nuit) sous agitation

Changer le méthanol et stocker à -20°C.

 

Variante pour les régénérats : placer directement les régénérats coupés dans 2ml de Fix et procéder.

 

PFA 16 %

Dissoudre 16% de poudre paraformaldehyde dans le PBS 1x en agitant et en chauffant à 65°C. La dissolution est obtenue en ajoutant progressivement du NaOH 2M jusqu’à dissolution complète. Après dissolution, attendre que la solution revienne à RT puis ajuster le pH à 7,5. Filtrer à 0,22 mm. Aliquoter dans des Falcons de 15 ml et congeler.