Microscope super résolution SIM, PALM, STORM

La limite de la résolution optique pour distinguer deux molécules très proches est définie par la distance de Rayleigh (0,61λ/NA). Avec la microscopie classique on ne peut pas distinguer deux molécules situées à une distance inférieur à cette distance Rayleigh.

La microscopie à molécule unique permet la détection d’une molécule unique marquée avec un fluorophore et ensuite la localisation du centre de sa tache de diffraction (fit gaussien). La précision de la localisation dépend principalement du nombre de photons détectés. Cette technique nous permet de localiser la position des molécules avec une précision de l’ordre de 10-20nm, inférieure à la limite de résolution optique. Par contre, si plusieurs molécules se trouvent dans la même tache de diffraction la super-localisation de leur position n’est pas possible.
Les techniques de PALM et de STORM reposent sur un principe semblable au pointillisme. Pour chaque acquisition, une fraction des molécules fluorescentes est utilisée, afin de distinguer chaque molécule émettrice. L’accumulation des acquisitions permet la reconstitution d’une image super-résolue (figure 1).

PALM : PhotoActivated Localization Microscopy

Le développement de nouvelles sondes fluorescentes (milieu des années 2000) a ouvert la voie à de nouvelles stratégies de microscopie de fluorescence. L’utilisation des protéines photoactivables et photoconvertibles ont permis le développement de la microscopie PALM (PA-GFP, PA-tagRFP, PA-mCherry, mEos2, Dendra2, etc). C’est une technique basée sur la détection des molécules uniques. A l’aide de la lumière ultraviolette (405nm), les molécules photo-activables vont devenir fluorescentes ou les molécules photoconvertibles vont changer le spectre d’émission. En utilisant ce type de molécules avec 2 faisceaux laser (une pour la photoactivation ou photoconversion et l’autre pour la lecture), on excite chaque fois un faible nombre des molécules, on les détecte (=localisation avec une précision au dessous de la limite de diffraction), on les photoblanchit et ensuite on excite et détecte d’autres qui seront photoactivées ou photconverties par le faisceau UV. L’image finale consiste en la somme de toutes les images détectées et est une image super-résolue.  Avec cette technique et l’utilisation de protéines fluorescentes, on peut effectuer des expériences avec des cellules vivantes.

STORM : STochastic Optical Reconstruction Microscopy

Des sondes organiques (paire Cy3-Cy5) sont utilisées en microscopie de reconstitution optique stochastique (STORM). Le dSTORM (direct STORM) est une technique qui utilise un ou plusieurs marqueurs organiques et un tampon ayant des propriétés oxydo-réductrices.  Avec ce tampon et un faisceau dans l’UV on peut contrôler le taux de clignotement des marqueurs, afin d’imager chaque fois une densité faible des molécules, pour avoir ensuite une localisation avec une précision au-dessous de la limite de résolution.
Les marqueurs organiques sont couplés aux anticorps, donc les cellules sont perméabilisées pour réaliser les marquages intracellulaires. Le choix pour faire des expériences avec des cellules vivantes est très limité. Par contre, le signal  (et donc la précision sur la localisation) est élevé, grâce à l’utilisation des molécules organiques. En plus, le choix des molécules est large (la plupart des Alexa Fluor et ATTO) et il est possible d’utiliser plusieurs fluorophores, pour des expériences à 2 ou 3 couleurs.

Principe du SIM

La limite de la résolution optique pour distinguer deux molécules très proches est définie par la distance de Rayleigh (0,61λ/NA). Avec la microscopie classique on ne peut pas distinguer deux molécules situées à une distance inférieure à cette distance Rayleigh. La microscopie SIM (Structured Illuminated Microscopy) permet d’obtenir un gain de résolution d’un facteur 2 sur toutes les directions, donc d’un facteur 8 en volume.

La microscopie SIM est basée sur l’utilisation d’une illumination structurée (pattern sinusoïdale) pour exciter les échantillons fluorescents.  Le pattern d’illumination est superposé avec le pattern des structures dans l’échantillon et leur interférence produit un troisième pattern caractéristique, les franges Moiré (figure 1).

Les franges Moiré ont une fréquence spatiale plus basse que les structures originales de l’échantillon et donc peuvent être transmises par la lentille de l’objective et on peut avoir leur image. Les 3 patterns sont indépendants et peuvent être utilisés pour connaître les informations super-résolues de l’échantillon, c’est à dire récupérer des fréquences hautes, qui normalement ne peuvent pas passer par l’objectif du microscope. Afin d’avoir un gain de la résolution isotrope, on récupère pour chaque plan des images pour 3 orientations différents de la grille et pour 5 phases différentes du pattern d’illumination.
Après avoir récupéré les images pour des orientations et des phases différentes de la grille avec le logiciel ZEN (Zeiss) nous pouvons faire la reconstruction des images (en passant par les Transformations de Fourier) et construire l’image super-résolue de l’échantillon (gain 3D en résolution d’un facteur 2).
Des images super-résolues en trois dimensions sont possibles. Il n’y a pas de restriction au choix des fluorophores utilisés