Microscope multi-photon, SHG, THG

La microscopie à excitation à deux photons est une alternative à la microscopie confocale. Elle permet une observation de la fluorescence à une plus grande profondeur limite le photoblanchiment et la phototoxicité. Elle est particulièrement adaptée dans le cas d’observation d’échantillons épais et vivants sur une longue durée mais aussi d’échantillons transparisés jusqu’à 1mm.

 

Principe

Tout comme la microscopie confocale, la microscopie multi-photon (ou bi-photon) utilise un laser pulsé pour exciter un marqueur fluorescent d’un échantillon et un détecteur pour l’acquisition de la lumière d’émission.
Cependant, le laser utilisé en microscopie deux-photon permet l’excitation d’un marqueur fluorescent par son absorption simultanée de l’énergie de deux photons au lieu d’un seul en microscopie conventionnelle. Le laser est pulsé afin d’envoyer des paquets de photons fortement concentrés (fortes puissances crêtes)  et d’augmenter les chances d’absorption simultanée des photons. Les deux photons absorbés quasi simultanément le sont uniquement au point focal ou la lumière est la plus concentrée et doivent être de longueur d’onde proche. Les deux photons absorbés sont de faible énergie et ont le même effet qu’un photon absorbé de plus forte énergie.

Ces caractéristiques mènent à plusieurs avantages :

• Les photons étant de plus faible énergie, leur longueur d’onde est plus grande (proche infrarouge pour les fluorophores absorbant dans le visible). Les grandes longueurs d’onde utilisées sont moins dommageables pour l’échantillon et pénètrent d’avantage dans les tissus que ceux de plus courte longueur d’onde.
• L’absorption de l’énergie de plusieurs photons sera confinée à la région focale. La fluorescence est donc émise uniquement à partir de cette région, il n’y a pas de lumière provenant d’en dehors du focus qui pourrait rendre l’image floue. Cela crée les conditions d’une image confocale ne nécessitant pas de pinhole à l’émission.
• Les processus photodynamiques tels que la destruction irréversible des molécules fluorescentes ou la production de radicaux libres ne se produisent qu’à la région focale. Minimisant souvent l’invasivité de la microscopie bi-photonique comparativement à la microscopie confocale mono-photon.
• La longueur d’onde d’excitation bi-photon est typiquement deux fois la longueur d’onde de l’excitation mono-photon. La séparation entre les deux spectres d’excitation et d’émission assure que la lumière d’excitation sera bien filtrée et que la lumière émise sera détectée.