Cytométrie en flux

La cytométrie en flux est une technique haut-débit qui permet l’analyse multiparamétrique quantitative (diffusion de la lumière, intensités de fluorescence) à l’échelle de la cellule unique.

PRINCIPE

La suspension de cellules (ou d’éléments) est entrainée jusqu’à une flow cell en quartz par un système de pression (ou pompe péristaltique). Les cellules sont alors centrées dans une veine liquide étroite grâce à un liquide de gaine (focalisation hydrodynamique). Les cellules (ou éléments) sont illuminées de manière séquentiel par un ou plusieurs faisceau(x) laser.Les signaux émis et d’intérêts (propriétés de diffusion, autofluorescence, fluorescence) sont collectés par des photodétecteurs (PMTs). Le signal lumineux est converti en un pulse électrique, puis en signal analogique.

Plusieurs signaux sont collectés :

La lumière diffusée aux petits angles (Forward Scatter, FSC) est collectée dans l’axe du faisceau du laser. Elle correspond à la diffraction et renseigne sur la taille des particules,
La lumière diffusée aux grands angles (Side Scatter, SSC) est collectée à 90° par rapport au faisceau laser. Il s’agit d’un mélange de diffusion, de réflexion et de réfraction qui renseigne sur la structure interne de la cellule,
La fluorescence est collectée à 90° par rapport au faisceau lumineux. Elle peut être une autofluorescence (lumière émise par la cellule elle-même), ou résulter d’un marquage par un ou plusieurs fluorochromes.

Dans le cas du tri, un quartz piézo-électrique crée une vibration sur une buse en sortie de la flow cell, produisant ainsi une ondulation de la veine liquide qui va se briser en formant des gouttelettes.

Lorsque la cellule analysée correspond à une cellule d’intérêt (classée dans une fenêtre de tri), une charge électrique est appliquée sur l’ensemble de la veine liquide au moment où cette cellule se situe à l’extrémité du jet. La gouttelette se détache alors du jet en conservant l’excès de charge (+ ou -). Puis elle est déviée en fonction de cette charge en passant entre deux plaques à haute tension créant un champ électromagnétique pour être collectée dans un tube ou dans une plaque multi-puits.

En jouant sur l’intensité et la polarité de la charge électrique appliquée à l’ensemble du jet, il est possible de trier simultanément plusieurs populations en même temps.

Les cytomètres en flux possèdent de manière inhérente un système optique, fluidique et électronique, mais avec des propriétés différentes.

Les principales applications sont :

Immunophénotypage
Cycle cellulaire, mesure de prolifération, taille de génome
Viabilité, Apoptose
Expression de gène par protéine reportrice fluorescente (GFP, mCherry, mScarlet, senseur FRET…)
Analyse fonctionnelle, flux métabolique

Certaines mesures peuvent être associées entre elles, et accompagnées d’un tri des cellules sur la base des propriétés analysées.

EQUIPEMENT DISPONIBLE

BD FACSAria Fusion

Configuration optique : 5 lasers, 18 PMTS

Bleu : 488nm (4 paramètres)
Rouge : 633nm (3 paramètres)
Violet : 405nm (4 paramètres)
YG : 561nm (4 paramètres)
UV : 355nm (3 paramètres)

BD Accuri C6 plus

2 lasers, 4 détecteurs

Bleu : 488nm (3 paramètres)
Rouge : 640nm (1 paramètre)