Synthèse de sondes froides

 

Equipe Balavoine / Vervoort (20/12/13), Institut Jacques Monod, Paris.

 

Synthèse de sondes DIG ou Fluo pour hybridations in situ

Pré Requis avant de commencer la synthèse :

– Le fragment d’ADN doit être inséré dans un plasmide comprenant les sites T7 et SP6.

– Définir le sens de l’insert dans le plasmide à l’aide de la séquence, sens ou anti-sens.

– Posséder à 1.5 à 2 µg d’ADN.

Attention

Il faut linéariser le plasmide avec une enzyme de restriction bien placée (ajout du minimum de sequence de plasmide a la sonde, donc idéalement dans les polylinkers) et qui ne coupe pas dans l’insert. Donc, vérifier que le site de restriction de l’enzyme n’est pas présent dans la séquence de l’insert et ne coupe qu’une seule fois le plasmide. De plus, vérifier le lieu de coupure de l’enzyme choisie, les positions de T7 et SP6 par rapport à cette enzyme et le sens de la polymérisation.

Jour 1

• Digérer le plasmide à l’aide d’une enzyme judicieusement choisie.

Plasmide : volume en fonction de la concentration (partir idéalement de 2 microgrammes)

Tampon 10 X adapté à l’enzyme (cf tableau correspondance)

Enzyme : 1 µl (1U/microgramme en théorie, eviter d’aller au dela de 10% du V final à cause du glycerol)

Eau stérile (ou DEPC) : volume pour compléter au volume adapté (50 µl final)

Mettre à digérer 1 h à 1h30 à 37 °C.

• Vérifier la digestion sur gel d’électrophorèse à 0.8% (prélever 1µl d’ADN digéré et non digéré pour la comparaison).
• Purifier à l’aide du kit de PCR purification.
• Doser au nanodrop.

Jour 2

• Synthèse de la sonde

ADN linéarisé (1 à 2 µg)+ eau stérile	14,5 µl
Protector RNase inhibitor (Roche)	0,5 µl
Dig/Fluo RNA labeling Mix (Roche)	2 µl
Transcription buffer 10X (Roche)	2 µl
RNA polymerase T7 ou SP6 (Roche)	1 µl
Volume total	20 µl

 

Volume total dans chaque tube : 20µl.

Mélanger et centrifuger brièvement.

• Incuber 2 heures à 37°C au bain marie.
• Au bout d’une heure, ajouter 1 µl d’enzyme T7 ou SP6
• Ajouter 66,5 µl d’H2O RNase-free, 10 µl de tampon DNAse et 2,5 µl de DNAse 1 pendant 15 min à 37 °C
• Prélever 5 µl pour vérifier par électrophorèse à 1.5 %
• Ajouter 350 µl de buffer RLT, mixer puis ajouter 250 µl d’Ethanol 100% et mixer.
• Purifier à l’aide du kit RNeasy (Qiagen) (RNA cleanup, step 3).
• Doser au nanodrop.
• Resuspendre dans du TH, indiquer la concentration et mettre à -20 °C.