Résultats récents

 

 

Nos résultats principaux sont :
Découverte du mécanisme moléculaire impliqué dans l’endocytose en réponse à la présence de glucose. Chez la levure, l’orthologue de la kinase AMPK (5’-AMP activated kinase) appelée Snf1 est active en absence de glucose. Ceci conduit à une phospho-inhibition de la protéine ART Rod1 (aussi appelée Art4). L’ajout de glucose conduit à la déphosphorylation de Rod1 (via la phosphatase PP1), permettant son ubiquitylation par Rsp5. Cette forme est spécifique du glucose et correspond à la forme active de Rod1, compétente pour l’endocytose (Figure 1). Pour plus de détails, voir Becuwe et al., J Cell Biol 2012.

 

Figure 1. Molecular mechanism of glucose-induced endocytosis. The post-translational modifications on the arrestin-related protein Rod1 are regulated by glucose availability and control its activity in glucose-induced endocytosis. Inset: Western blot showing drastic changes in the migration pattern of Rod1 when cells are transferred from glucose medium (lane 1) to lactate medium (lane 2) and then back again to glucose (lanes 3 & 4).]

 

Les protéines ARTs peuvent agir à d’autres compartiments que la membrane plasmique : un nouveau rôle pour le réseau trans-Golgien dans le contrôle des décisions d’endocytose. Nous avons montré que certains transporteurs, après leur endocytose, sont redirigés dans une voie de trafic rétrograde des endosomes vers le trans-Golgi (TGN). Au TGN, les transporteurs peuvent soit recycler vers la membrane plasmique, soit poursuivre dans la voie de dégradation vers la vacuole. L’adressage vers la vacuole requiert l’ubiquitylation des transporteurs au TGN et dépend de Rod1 (Figure 2). D’ailleurs, Rod1 est partiellement redistribué vers le TGN en réponse à l’ajout de glucose, de façon très dynamique (Film 1). Pour plus de détails, voir Becuwe & Léon, eLife 2014

 

Figure 2. Double fonction de Rod1 dans la régulation de l’endocytose des transporteurs et leur recyclage. En milieu lactate, Jen1 est synthétisé et adressé vers la membrane plasmique.
Rod1 est inactive (phosphorylée) et cytosolique. Lors d’ajout de glucose, Rod1 est active
et permet l’endocytose de transporteurs à la membrane plasmique (1) mais se relocalise aussi
au TGN (2). Au TGN, Rod1 contrôle le devenir (i) des transporteurs internalisés qui ont été ciblés dans la voie rétrograde vers le TGN (voie dépendante de Ypt6 et du complexe VFT=Vps Fifty-Three),  ainsi que (ii) des transporteurs en transit dans la voie de sécrétion. L’adressage du TGN vers la vacuole dépend de Rod1, et des adaptateurs de clathrine Gga1 ou Gga2 (GGAs). Lors d’un retrait du glucose, peu après l’initiation de l’endocytose, Rod1 peut être rephosphorylé, conduisant à sa dissociation du TGN et au recyclage de Jen1 vers la membrane plasmique.
© Sébastien LEON, CNRS/IJM]

 

Film 1. Localisation dynamique de Rod1-GFP au réseau trans-Golgien par la présence de glucose. Des levures exprimant Rod1-GFP ont été cultivées en milieu lactate et observées pendant 3 cycles d’ajout/retrait de glucose (pulses de 5 minutes)
(ImagoSeine imaging facility, IJM). © Sébastien LEON, CNRS/IJM]

 

– Coopération fonctionnelle au sein de la famille des arrestines. L’étude approfondie de l’endocytose de Jen1 en réponse au glucose par microfluidique (paragraphe précédent) nous a permis de réaliser une redondance probable entre Rod1 et une arrestine alors non identifiée. Nous avons découvert que l’arrestine nommée Bul1 peut compenser partiellement pour l’absence de Rod1 à la membrane plasmique, mais en revanche elle ne peut se substituer à ses fonctions identifiées au niveau du TGN (Figure 3). Les modifications post-traductionnelles de Bul1 sont régulées par la présence de glucose via une phosphatase de type PP2A. Ceci indique une coopération fonctionnelle entre plusieurs ARTs à différents compartiments successifs au cours de l’endocytose, participant à la robustesse de la réponse.

Pour plus de détails, voir Hovsepian et al., Mol Biol Cell 2018

 

Figure 3. Les arrestines Rod1 et Bul1 coopèrent pour certaines étapes de l’endocytose de Jen1 en réponse à la présence de glucose. © Sébastien LEON, CNRS/IJM]

 

 

Mécanisme d’endocytose des transporteurs de glucose lors d’une carence. Au cours de l’étude de l’effet de la déplétion en glucose du milieu, nous avons observé que plusieurs transporteurs de glucose sont endocytés par un processus dépendant de la protéine ART Csr2 (aussi appelée Art8). L’expression de Csr2 est régulée au niveau transcriptionnel par la kinase Snf1/AMPK, et représente ainsi la première ART induite dans les conditions d’endocytose de ses cargos. L’ubiquitylation de Csr2 est aussi essentielle pour son activité et se produit sur un site conservé dans beaucoup d’autres ARTs. Enfin, Csr2 est déubiquitylée lors d’un ajout de glucose, conduisant vraisemblablement à son inactivation. Ceci implique la phosphorylation de Csr2, la protéine Kinase A, et des protéines 14-3-3 (Figure 4). Pour plus de détails, voir Hovsepian et al., J Cell Biol 2017

 

Figure 4. Régulation de la protéine ART Csr2 par la disponibilité en glucose. Gauche : en présence de glucose, CSR2 est réprimé transcriptionnellement par les répresseurs Mig1/Mig2. Lors d’un retrait du glucose (centre), l’activation de Snf1/AMPK conduit à la dé-répression de CSR2. Csr2 est constitutivement ubiquitylée par Rsp5 sur une lysine conservée. Droite : l’ajout de glucose conduit à la phosphorylation de Csr2 par une voie dépendant de PKA (Protéine kinase A), conduisant à une interaction de Csr2 avec les protéines 14-3-3 et sa déubiquitylation. Csr2 est aussi dégradée par le protéasome. Encart : Western blot montrant les changements d’expression et de modifications post-traductionnelles de Csr2 du transfert des cellules d’un milieu glucose à un milieu lactate, puis après ajout de glucose dans ce milieu. © Sébastien LEON, CNRS/IJM]

 

– Mécanismes de toxicité du 2-déoxyglucose et mécanismes de résistance associés.

Au cours de l’étude des effets de l’inhibiteur métabolique et analogue du glucose, le 2-désoxyglucose (2DG), sur le trafic membranaire, nous avons caractérisé les effets de cette drogue sur le protéome cellulaire. Ces résultats révèlent que le 2DG entraîne la surexpression de phosphatases permettant de déphosphoryler la forme phosphorylée et toxique du 2DG, le 2DG-6-phosphate. Nous avons montré que le 2DG cause un certain nombres de stress cellulaires et déclenche l’activation de plusieurs voies de signalisation (MAPK, UPR) qui permettent l’induction de ces enzymes en charge de détoxifier le 2DG6P (Figure 5). La caractérisation des mutants spontanés de levure devenus résistants au 2DG par séquençage de leur génomes a révélé que les phosphatases étudiées participent aux stratégies de résistance de la plupart de ces mutants. Une enzyme similaire, nommée HDHD1, a été identifiée chez l’homme. Sa surexpression protège une lignée cellulaire humaine de la mort cellulaire induite par le 2DG. Cette découverte suggère que la surexpression d’HDHD1 dans certains tissus ou tumeurs pourrait moduler leur sensibilité au 2DG, mais aussi interférer avec la détection de certaines tumeurs par des méthodes d’imagerie existantes basées sur des dérivés du 2DG.

Pour plus de détails, voir Defenouillère, Verraes et al. (2019)

 

Figure 5. Le 2DG est importé dans les cellules et métabolisé en 2DG-6-phosphate, qui est toxique. Ceci entraîne plusieurs stress dans la cellule, dont certains vont entraîner l’expression d’enzymes appelées Dog1 et Dog2 qui peuvent détoxifier le 2DG6P. De plus, des mutations spontanées peuvent entraîner la résistance des cellules au 2DG, notamment via la surexpression de Dog1/Dog2. © Sébastien LEON, CNRS/IJM]