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Nous étudions le rôle d’une protéine sécrétée, appelée NODAL, dans la spécification des lignages cellulaires au cours de l’embryogénèse. Cette thématique nous a conduit à nous intéresser aussi au rôle de cette molécule dans la progression tumorale.

Les études menées chez l’embryon de souris ont montré que la spécification des destins cellulaires implique plusieurs voies de signalisation. Ces voies participent aussi à la maintenance et au renouveau des tissus chez l’adulte, des fonctions qui sont en causes dans de nombreuses pathologies. L’étude de leur implication et de leurs interactions pendant le développement embryonnaire, lorsque l’organisme est encore relativement simple, est donc particulièrement pertinente pour comprendre leur rôle plus tard, dans des contextes plus complexes.

NODAL est un membre de la famille des TGFß. Son signal est transmis par ce que l’on appelle la voie de signalisation ACTIVINE/NODAL, qui dépend des facteurs cytoplasmiques SMAD2 et 3. Le gène Nodal est requis pour la mise en place des axes embryonnaires. Il est aussi requis pour la spécification et la maintenance de diverses identités cellulaires, aussi bien embryonnaires qu’extra-embryonnaires. Plusieurs de ces types cellulaires ont en commun d’être motiles. Le locus Nodal a été l’objet de nombreuses études, ses séquences régulatrices ont été identifiées et caractérisées, et c’est devenu un modèle pour comprendre comment diverses influences (signaux TGFß, WNT et NOTCH, facteurs de pluripotence, etc.) sont intégrées et font qu’un gène est exprimé dans une certaine cellule à un moment donné. Chez l’adulte Nodal est exprimé dans des tissus qui sont renouvelés ou remodelés de façon périodique sous le contrôle de stimuli hormonaux, tels l’endomètre et la glande mammaire. Chez l’homme, l’expression de NODAL a été détectée dans les cellules tumorales de différents types de cancers, et elle a été associée à leur plasticité et à leur comportement invasif, suggérant que son rôle dans ce contexte reflète ce que l’on sait de ses fonctions dans les tissus  adultes et embryonnaires.

Nous employons actuellement une combinaison d’approches de génétique, de biologie moléculaire, de transcriptomique et d’imagerie pour étudier le rôle de NODAL pendant la spécification et la différenciation des premiers lignages cellulaires, aussi bien chez l’embryon de souris que dans des modèles de culture in vitro reposant sur l’utilisation de cellules souches embryonnaires. L’étude de ces modèles in vitro est réalisée en collaboration avec des biophysiciens qui apportent leur expertise en microfluidique, traitement de données quantitatives et modélisation. Enfin, nous utilisons des approches de biologie cellulaire, de génétique, de biochimie, de transcriptomique et de spectrométrie de masse pour étudier les mécanismes par lesquels un gène antisens du gène NODAL promeut la progression tumorale dans un modèle cellulaire de mélanome humain.

 

Étude du rôle du gène Nodal au cours du développement préimplantatoire

 

L’expression de Nodal est détectée pour la première fois dans le masse cellulaire interne (MCI) du blastocyste au jour embryonnaire 3,5 (E3.5) (Granier et al., 2011 ; Takaoka et al., 2006 ; Takaoka et al., 2017). À E3.75, lorsque la MCI donne naissance à l’épiblaste pluripotent (Epi) et à l’endoderme primitif (PrE), un tissu extra-embryonnaire, l’expression de Nodal persiste dans l’Epi mais devient plus forte dans les cellules du PrE. A E4.5, lorsque l’embryon s’implante, l’expression de Nodal est diminue dans le PrE mais augmente dans l’Epi. On a constaté que l’activité de la voie de signalisation ACTIVINE/NODAL à ces stades suit de près l’expression de Nodal (Granier et al., 2011).

Le défaut le plus précoce décrit chez les embryons Nodal-/- jusqu’à présent est leur incapacité à activer l’expression de Lefty1, un antagoniste de NODAL qui est également une cible de sa voie de signalisation, dans les cellules de la MCI et du PrE entre E3.5 et E4.5 (Takaoka et al., 2017). Les embryons E4,5 Nodal-/- comprennent néanmoins les trois couches cellulaires qui constituent normalement un blastocyste en cours d’implantation. Ce n’est qu’après l’implantation que leurs défauts de développement caractéristiques, l’incapacité à établir des identités cellulaires embryonnaires et extra-embryonnaires spécifiques, à établir un axe AP et à gastruler, ont été caractérisés (Robertson 2014). Outre Lefty1, d’autres cibles possibles de NODAL aux stades préimplantatoires ont été identifiées dans des études sur les cellules souches embryonnaires (ESCs), qui sont représentatives des cellules Epi précoces (Galvin et al., 2010; Mullen et al., 2011). Compte tenu de la prééminence de certaines de ces cibles, qui comprennent des facteurs de transcription et des composants des voies de signalisation, l’absence d’un phénotype préimplantatoire peut sembler surprenante. Une raison possible de cette absence apparente de défauts précoces est la présence à ces stades de ligands d’origine zygotique (ACTIVINE) et utérine (ACTIVINE, NODAL) susceptibles de compenser l’absence de NODAL zygotique (Papanayotou & Collignon, 2014). Le fait que la signalisation ACTIVINE/NODAL est active dans l’embryon bien avant que l’expression de Nodal zygotique ne commence, est en accord avec cette possibilité (James et al., 2005).

Afin de révéler les contributions respectives de NODAL et d’ACTIVINE à la formation du blastocyste nous réalisons donc actuellement une comparaison des phénotypes d’embryons exposés à divers traitements inducteurs ou inhibiteurs avec ceux d’embryons Nodal-/- fraîchement disséqués ou cultivés ex-utero.

Ce projet a été soutenu par le programme Emergence (IDEX Université de Paris), l’Ecole Doctorale BioSPC et l’EUR G.E.N.E.

 

Etude du mécanisme de la régionalisation de la ligne primitive

 

Nous cherchons à comprendre comment la ligne primitive (LP), dont la formation marque le début de la gastrulation, est régionalisée chez l’embryon de souris. La LP apparaît au sein de l’épiblaste proximal postérieur, et s’étend progressivement vers son extrémité distale. Les cellules émergeant précocement de la région proximale/postérieure de la LP vont migrer de manière proximale pour former le mésoderme extra-embryonnaire ou de manière latérale pour former le mésoderme embryonnaire, tandis que les cellules émergeant de sa région distale/antérieure vont former le mésoderme axial et l’endoderme définitif. Des mutations de perte de fonction complètes et partielles ont montré que trois protéines sécrétées, WNT3, BMP4 et NODAL, sont essentielles à la formation et à la régionalisation de la PS. Ces études ont abouties à un modèle dans lequel des gradients opposés de signalisation de NODAL et de BMP4 régissent l’allocation des destins cellulaires de la LP, la signalisation BMP la plus élevée favorisant le mésoderme extra-embryonnaire dans la LP postérieure, et la signalisation NODAL la plus élevée favorisant l’endoderme définitif dans la LP antérieure (Tam et al., 2006 ; Arnold & Robertson 2007).  S’il y a bien des indications qu’un tel gradient de signalisation BMP existe (Yamamoto et al., 2009), c’est beaucoup moins clair pour la signalisation NODAL (Camacho-Aguilar & Warmflash, 2020). Des résultats obtenus chez le poisson zèbre suggèrent qu’une longue exposition à la signalisation NODAL favorise effectivement les destins PS antérieurs (Hill, 2018), mais dans l’embryon de souris, il a été difficile d’établir un lien entre exposition au ligand et destin cellulaire. En outre, l’interdépendance des expressions de Wnt3, Bmp4 et Nodal, et leurs rôles dans la régionalisation de l’embryon à des stades plus précoces rendent difficile de séparer, par exemple, l’effet du manque de NODAL de ceux d’un manque de BMP4 ou de WNT3 dans les défauts de régionalisation des embryons Nodal-/-. Enfin, la faible quantité de matériel biologique dans un embryon rend difficile l’application de méthodes biochimiques pour étudier comment les décisions relatives à la détermination de l’identité cellulaire intègrent ces 3 signaux. Cependant, le développement récent de méthodes qui utilisent des cellules pluripotentes pour récapituler la gastrulation in vitro, permettant ainsi un meilleur contrôle des conditions dans lesquelles la régionalisation a lieu, rend maintenant possibles ces investigations.

Afin de comparer les événements qui se déroulent in vitro avec ceux qui se déroulent réellement dans l’embryon de souris, notre collaborateur Benoit Sorre (UMR168 Institut Curie/CNRS) a adapté une méthode qu’il avait initialement développée avec des cellules souches embryonnaires humaines (hESCs) (Warmflash et al., 2014) à l’utilisation de cellules souches pluripotentes de souris représentatives de l’épiblaste pré-gastrulation, les EpiLCs (Plouhinec et al., 2021). Ce modèle in vitro de gastrulation en 2D, ou gastruloïde 2D de souris (2DmGas), présente de nombreux avantages. Il est simple à mettre en oeuvre, plusieurs colonies peuvent être générées en même temps, et il se prête à l’imagerie et à la quantification. Nous avons constaté, comme d’autres (Morgani et al., 2018), que les 2DmGas, s’auto-organisent de manière reproductible lorsqu’ils sont exposés à BMP4, formant en 48H une LP qui donne ensuite naissance à un anneau de cellules mésodermiques entourant un noyau d’ectoderme. Nous utilisons maintenant un ensemble d’approches (Immunofluorescence, hybridation in situ, RT-qPCR, analyse en composantes principales, RNAseq en cellules uniques, RT-qPCR en cellules uniques) pour étudier dans ce modèle le mécanisme qui sous-tend la régionalisation de la LP.

Ce projet a été soutenu par l’INCa et l’Ecole Doctorale BioSPC.

Colonie EpiLC de 500  mm de diamètre après stimulation BMP4 pendant 36h. A gauche, le marquage des noyaux au Hoechst (bleu) permet de visualiser l’ensemble des cellules, à droite le marquage par immunofluorescence permet d’identifier les cellules de la ligne primitive (BRA en rouge) et du mésoderme extra-embryonnaires (CDX2 en vert) ou embryonnaires (FOXA2 en cyan) qui en sont issus.

 

Colonie EpiLC de 500  mm de diamètre après stimulation BMP4 pendant 36h. A gauche, le marquage des noyaux au Hoechst (bleu) permet de visualiser l’ensemble des cellules, à droite le marquage par immunofluorescence permet d’identifier les cellules de la ligne primitive (BRA en rouge) et du mésoderme extra-embryonnaires (CDX2 en vert) ou embryonnaires (FOXA2 en cyan) qui en sont issus.

 

Étude du rôle du gène LADON, antisens de NODAL, dans la progression tumorale du mélanome humain

 

L’implication de NODAL dans la progression tumorale et les métastases a été décrite pour la première fois dans des lignées cellulaires de mélanome (Topczewska et al., 2006), mais alors que des preuves soutenant un tel rôle pour ce ligand ont été obtenues dans d’autres types de cancer, sa contribution réelle à la formation de métastases dans le mélanome a été contestée (Donovan et al., 2017; Hooijkaas et al., 2011), notamment parce que son expression n’était pas toujours détectée. Une revue des données disponibles sur l’expression de NODAL dans les cellules cancéreuses a suggéré l’existence de variants d’épissage (Strizzi et al., 2012), incluant tous le deuxième exon du gène mais dépourvus parfois, notamment dans les lignées cellulaires de mélanome, de son troisième (et dernier) exon et donc de la capacité à produire un ligand fonctionnel. Cette observation fournit une explication aux différences constatées entre les niveaux d’expression de NODAL rapportés par différentes études pour ces lignées cellulaires, mais soulève également la possibilité d’une fonction indépendante du ligand du gène.

Nous avons donc utilisé l’édition du génome pour supprimer l’exon2 de NODAL dans la lignée cellulaire de mélanome A375, un modèle cellulaire reconnu de mélanome humain précédemment décrit comme exprimant NODAL (Topczewska et al., 2006). Cette mutation a réduit de manière drastique la capacité de ces cellules à acquérir un phénotype invasif. Cependant, l’inhibition ou la stimulation exogène de la signalisation ACTIVINE/NODAL n’a eu aucun effet sur le comportement des cellules A375, et nous n’avons pas pu détecter l’expression de NODAL dans ces cellules, ce qui implique que ni le ligand NODAL ni son ARNm ne jouent un rôle dans ce phénotype. Nous avons cependant découvert que la mutation désactivait l’expression d’un transcrit antisens naturel de 1750 nucléotides de long, chevauchant l’exon2 entier de NODAL (Fig.1). Identifié à l’origine dans le glioblastome, il était jusqu’à présent passé largement inaperçu. Nous avons appelé ce transcrit LADON et confirmé qu’il s’agit bien de ce que des études antérieures avaient identifié par erreur comme étant l’expression de NODAL dans les lignées cellulaires de mélanome, ainsi que dans certaines autres lignées cellulaires cancéreuses. L’expression forcée de LADON dans des cellules A375 mutantes pour l’exon2 de NODAL a permis de sauver les défauts constatés dans ces cellules, et a donc confirmé son implication dans l’acquisition d’un comportement invasif.

Il existe de multiples exemples de l’implication des longs ARN non codants (lncRNA) dans la physiologie des tissus et dans la dérégulation des processus cellulaires qui aboutissent au cancer (Huarte 2015 ; Iyer et al., 2015 ; Schmitt & Chang). C’est la raison de l’intérêt que suscitent actuellement les lncRNA en tant que biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic, mais aussi en tant que cibles potentielles pour la thérapie ou en tant qu’outils pour corriger l’expression génique défectueuse qui sous-tend le cancer et d’autres pathologies (Wahlestedt 2013 ; Slaby et al., 2017). Bien que nous ayons caractérisé certains des événements qui dépendent de l’expression de LADON dans les cellules de mélanome, nous ne savons pas comment il les déclenche réellement. Nos objectifs sont donc d’identifier les cibles directes de LADON et de caractériser la manière dont il contrôle leur expression.

Ce projet a été soutenu par l’INCa et le GEFLUC.

 

Cellules de mélanome de la lignée A375, dont l’acquisition d’un comportement invasif dépend de l’expression du transcrit LADON. Les noyaux sont en bleu et le cytosquelette en rouge.

 

Mots clés

Embryon de souris, cellules souches embryonnaires, mélanome humain, signalisation ACTIVINE/NODAL, régulation de l’expression génétique, enhancers, pluripotence.