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Environ 15% des couples sont confrontés à un problème d’infertilité. Les causes potentielles en sont la mauvaise qualité des cellules sexuelles ou gamètes  (spermatozoïde et ovocyte), ou des défauts lors du développement de l’embryon. Un enjeu majeur de la biologie de la reproduction est d’en comprendre les mécanismes.

Au cours de la division cellulaire, les chromosomes, supports de l’information génétique, sont répartis en deux lots égaux entre les cellules filles. La répartition fidèle des chromosomes est un élément fondamental de la stabilité génétique des cellules et des organismes. L’aneuploïdie, qui correspond à la présence d’un nombre incorrect de chromosomes, conduit à la formation d’embryons généralement non viables ou présentant des défauts sévères de développement. Notre projet vise à étudier les mécanismes garantissant la formation d’ovocytes et d’embryons contenant un nombre correct de chromosomes, élément essentiel à la reproduction.

Nous étudions pour cela les mécanismes d’assemblage et le fonctionnement de la machinerie cellulaire permettant la répartition correcte des chromosomes en méiose et en mitose. Cette machinerie se compose d’un fuseau de division formé de microtubules (en vert sur la figure 1) dont certains contactent les chromosomes (magenta). Les interactions entre microtubules du fuseau et chromosomes sont au centre du processus de ségrégation des chromosomes et sont régulées de façon différente en méiose et en mitose.

Notre approche est multidisciplinaire et s’appuie sur des outils génétiques, biochimiques, cellulaires et microscopiques de pointe. Notre modèle d’étude favori est le ver nématode Caenorhabditis elegans qui partage avec les mammifères la grande majorité des gènes et des mécanismes clefs de la reproduction et du développement. Nous étudions également des vers nématodes « non modèles » afin de développer une compréhension évolutive des mécanismes de la division cellulaire dans le contexte de la reproduction.

 

Fugure 1 : Marquages immunofluorescents d’un fuseau méiotique d’ovocyte (à gauche) et d’un fuseau mitotique de zygote (à droite) chez C. elegans. Les microtubules sont en vert, les chromosomes en magenta et les deux centrosomes qui forment les pôles du fuseau en mitose sont en jaune. Notez l’absence de centrosomes aux pôles du fuseau méiotique et sa forme caractéristique « en tonneau ».

 

Axe 1/ Divisions méiotiques de l’ovocyte :

 

En mitose, les microtubules du fuseau sont assemblés à partir des centrosomes (Figure 1, jaune). Dans les ovocytes, les centrosomes sont éliminés précocement. L’assemblage des fuseaux dans les ovocytes met donc en jeu des mécanismes atypiques mal connus. Nous avons mis au point une approche de microscopie in utero sur nématodes vivants qui nous a permis de décrire les étapes clefs de la formation des fuseaux acentrosomaux dans l’ovocyte de C. elegans (Vidéo 1).

 

Vidéo 1

 

Afin de déterminer les acteurs impliqués, nous combinons cette méthode d’imagerie confocale avec une approche de perte de fonction systématique des protéines associées aux microtubules et des moteurs microtubulaires. Nous utilisons également une approche in vitro de microscopie TIRF (Total Internal Reflection Microscopy) sur protéines recombinantes et microtubules individuels (Figure 2). Notre but est de déterminer le réseau d’acteurs nécessaire à la formation d’un fuseau en absence de centrosome, ainsi que de mettre en évidence les interactions fonctionnelles entre ces acteurs.

 

Figure 2

Axe 2/ Ségrégation des chromosomes dans l’ovocyte :

 

Les fuseaux acentrosomaux ont une forme caractéristique dite « en tonneau » (Figure 1), avec des pôles arrondis, due à l’absence de microtubules astraux (microtubules qui, en mitose, connectent normalement les pôles des fuseaux au cortex cellulaire). Cette forme atypique induit la mise en jeu de mécanismes spécifiques de ségrégation des chromosomes méiotiques. Par une approche de microscopie multimodale, combinant microscopie optique live d’ovocytes de C. elegans, ablation laser sur ovocytes vivants et microscopie électronique en tomographie, nous avons mis en évidence un mécanisme original de ségrégation des chromosomes « par poussée » exercée par les microtubules (Vidéo 2 et Figure 3). Nous combinons les différentes approches de microscopie avec des pertes de fonction ciblées d’acteurs clefs afin d’en déterminer les mécanismes moléculaires.

 

Figure 3

 

Video2

 

Nous avons, par ailleurs,  montré que la ségrégation « par poussée » ne dépend pas strictement des kinétochores, complexes multiprotéiques s’assemblant sur les chromosomes pour permettre la liaison des microtubules. Néanmoins ces derniers sont importants pour assurer la fidélité du mécanisme de ségrégation et éviter l’aneuploïdie ovocytaire. Nous avons récemment mis au point une méthode de microscopie live de deux canaux de fluorescence simultanément avec scan rapide en Z (Figure 4).

 

Figure 4

 

Cette méthode permet d’acquérir la totalité du volume de fuseau méiotique et des chromosomes en cours de ségrégation pendant toute la première division méiotique. Nous pouvons ainsi suivre la position de chaque chromosome individuellement pendant les étapes d’orientation, d’alignement et de ségrégation sur le fuseau méiotique. Cette approche nous permet donc de réaliser une analyse quantitative de la fonction de protéines candidates et d’en déterminer l’importance pour la ségrégation des chromosomes dans l’ovocyte de C. elegans.

 

Axe 3/ Évolution des mécanismes de la division méiotique chez les nématodes

 

Des défauts de ségrégation des chromosomes au cours de la méiose peuvent entraîner l’aneuploïdie des gamètes et de l’embryon, qui est une cause majeure de malformations congénitales et d’avortements spontanés chez l’homme. Cependant, bien qu’ils soient essentiels à la reproduction des organismes multicellulaires et donc à la continuité des espèces, les principes clés qui régissent la méiose, et en particulier la ségrégation chromosomique méiotique dans les ovocytes, sont encore mal compris. Une des principales raisons de ce manque de connaissances est la diversité des scénarios moléculaires qui ont été adoptés au cours de l’évolution pour réguler la ségrégation des chromosomes, en particulier dans les ovocytes. En effet, bien que la méiose soit hautement conservée chez les eucaryotes, les déviations de la “norme” sont omniprésentes et peuvent fournir des informations importantes sur la signification évolutive des mécanismes de la méiose. Il est donc de la plus haute importance d’apprécier la véritable diversité des caractéristiques méiotiques dans la nature, en considérant à la fois des organismes modèles bien caractérisés (comme C. elegans) et des organismes non modèles. Les nématodes représentent une situation idéale à cet égard : leur remarquable adaptabilité à diverses niches écologiques s’est accompagnée d’une extrême plasticité dans l’organisation du génome mais aussi dans les stratégies reproductives et méiotiques. Nous avons récemment commencé l’analyse de la méiose ovocytaire dans des espèces de nématodes non modèles présentant des caractéristiques spécifiques et atypiques susceptibles d’avoir un impact sur la ségrégation des chromosomes méiotiques (Vidéo 3).

 

Video3

 

Axe 4/ La première division mitotique du zygote de C. elegans

 

Dans le zygote de C. elegans, en mitose, les microtubules émanant des pôles du fuseau contactent soit le cortex embryonnaire (microtubules astraux), soit les chromosomes via les kinétochores (microtubules kinétochoriens). Les forces de traction exercées par les microtubules astraux sont transmises aux chromosomes par les microtubules kinétochoriens permettant ainsi la ségrégation des chromatides sœurs en anaphase (Vidéo 4).

 

Video4

Les kinétochores sont des complexes multiprotéiques constitués de plusieurs dizaines de protéines différentes. Parmi celles-ci, la kinase BUB-1, les protéines HCP-½ et la protéine de liaison aux microtubules CLS-2, forment un module impliqué dans le contrôle de la dynamique des microtubules kinétochoriens. Nous avons mis en évidence les rôles de ce module dans l’alignement et l’attachement correctes des chromosomes en métaphase, et dans la formation du fuseau central de microtubule en anaphase. Nous poursuivons l’analyse des différentes fonctions du module BUB-1/HCP-½/CLS-2 au cours de la première division mitotique du zygote de C. elegans. Nous développons, pour cela, une approche de mutagenèse ciblée couplée à la microscopie confocale sur embryons vivants. Cette approche nous permet de réaliser une analyse quantitative du rôle des différents acteurs à travers les étapes de la mitose (Figure 5).

 

Figure 5

 

 

Financements:

European Research Council ; Mairie De Paris ; Fondation pour la Recherche Médicale ; Agence Nationale de la Recherche

 

Collaborations: Jean-Marc Verbavatz (IJM) ; Lionel Pintard (IJM) ; Julie C. Canman (Columbia University, NYC, USA) ; Marie Delattre, (ENS, France) ; Peter Askjaer, (CABD, Spain) ; Peter Meister, (University of Bern, Switzerland)

 

Mots-clés: Division cellulaire, Méiose/Mitose, Cytosquelette, Ségrégation des chromosomes, Développement embryonnaire.