Hybridation in situ in toto NBT / BCIP
Platynereis dumerilii
Equipe Balavoine/Vervoort (20/12/13), Institut Jacques Monod, Paris.
Jour 1
Décongeler PFA16%: 65°C
Décongeler glycine 10x : 37°C
Réhydratation
Prélever dans les stocks d’embryons/MeOH la quantité désirée d’embryons/larves. Typiquement, la ponte d’une femelle permet dix sondes/condition (200 larves/tube). Pour les régénérats, une douzaine par sonde. Réaliser la réhydratation dans des tubes de 2ml. Attention à bien laisser sédimenter avant de pipeter le surnageant.
- 5min + agitation dans 75% MeOH / PBS Tween 0,1%
- 5min + agitation dans 50% MeOH / PBS Tween 0,1%
- 5min + agitation dans 25% MeOH / PBS Tween 0,1%
- 5min x2 + agitation dans PBS Tween 0,1%.
Pour les régénérats : recouper en laissant 1 segment, nettoyer le tube digestif sous bino en maintenant sur glace.
Digestion Protéinase K
Les traitements suivants se font dans les grands paniers baignant dans des couvercles de boites de cônes remplis de 50 ml de solution.
- Transférer les larves/régénérats dans les grands paniers dans le PBS Tween 0,1%. Préparer les bains de protéinase K, de glycine, de PFA et de PBS Tween 0,1% (x5)
- Transférer les grands paniers dans le bain de PK suivant les concentrations et temps suivants. Attention : sans agitation !
| Stage | T digestion | cº (µg/ml) | dilution stock: 20mg/ml |
| 1 to 15h | 30sec | 100 | 125µl dans 25ml |
| 24h | 1min | 100 | 125µl dans 25ml |
| 36h | 1min | 100 | 125µl dans 25ml |
| 48h | 1min | 100 | 125µl dans 25ml |
| 72h | 2min | 100 | 125µl dans 25ml |
| Régénérats classiques | 10min | 10 | 12.5µl dans 25ml |
| Régénérats tissus profonds | 3min | 100 | 125µl dans 25ml |
- Bref rinçage (30s-1min) dans PBS Tween 0,1% / Glycine 2mg/ml (stock 10X) [5ml glycine + 45 ml PBS] sans agitation !
- 20min + agitation dans PBS Tween 0,1% et PFA 4% [12 ml PFA 16% + 36 ml PBS + 48 µl Tween20]
- 5min x5 + agitation dans PBS Tween 0,1%
Hybridation
- Transférer le matériel dans les petits paniers avec PBS Tween 0,1%
- Pré-hybridation: transférer les petits paniers dans 400µl de TH, 1h- 1h30 à 65ºC.
- Dénaturer la sonde 10min à 80ºC (1000ng dans 1ml de TH convient généralement, à ajuster dans le cas de certains gène/sonde)
- Transférer les petits paniers dans des tubes 2ml à fond plat contenant 200 à 300µl de sonde dénaturée, préchauffés à 65°C au bain-marie, puis placer au four à 65ºC pendant au moins 16 heures.
Il est important à partir de ces étapes et jusqu’à la fin des lavages que les tubes restent constamment à 65 °C. Concrètement, les transferts des tubes du bain-marie au four et vice-versa doivent être faits le plus vite possible, de même que les transferts de petits paniers d’un tube à l’autre.
Jour 2 :
Lavages de la sonde
Ces lavages sont pratiqués avec des stocks de tube de 2 ml numérotés et réutilisés.
Préchauffer au bain marie les tubes de 2 ml avec les solutions de lavage à 65ºC – Incubation à 65º
- 30min x2 dans 1ml de SSC 4x, Tween 0.1% 50% formamide
- 15min x2 dans 1ml de SSC 2x, Tween 0.1%
- 30min x2 dans 1ml de SSC 0.2x, Tween 0.1%
| SSC 4x, Tween 0.1%, 50 % formamide | 50 ml |
| SSC 20x | 10 ml |
| formamide | 25 ml |
| Tween20 | 50 ml |
| H2O | qsp |
| SSC 2x, Tween 0.1% | 50 ml |
| SSC 20x | 5 ml |
| Tween20 | 50 ml |
| H2O | qsp |
| SSC 0.2x, Tween 0.1% | 50 ml |
| SSC 20x | 500 ml |
| Tween20 | 50 ml |
| H2O | qsp |
Incubation anticorps AP
- 1h + agitation Tºamb (ou OV 4ºC) dans 1ml de PBS Tween 0,1% et sheep serum 5%; pendant ce temps préincuber l’AC a Dig dans le PBS Tween 0,1%/sheep serum 5%
- 1h + agitation Tºamb (ou OV 4ºC) dans 800µl de PBS Tween 0,1% et sheep serum 5% et AC α Dig AP (1/4000e)
Jour 3 :
Lavages anticorps
- 5min x3 dans 1ml PBS Tween 0.1%
- 10min + agitation dans 1ml PBS Tween 0,1%
- 20min + agitation dans 1ml PBS Tween 0,1%
- 30min + agitation dans 1ml PBS Tween 0,1%
- 5min + agitation dans 1ml staining buffer
Coloration NBT/BCIP
- Transférer le matériel dans un eppendorf de 1,5 ml avec 1ml de staining buffer
- Laisser sédimenter 5min avec agitation dans staining buffer puis remplacer par 1 ml de solution de coloration
- Transférer dans des plaques à six puits pour observation
| Staining Buffer pH 9.5 | cº stock | cº finale | 100ml |
| Tris Cl pH 9.5 | 1M | 0.1M | 10ml |
| NaCl | 3M | 0.1M | 3,33ml |
| MgCl2 | 1M | 50 mM | 5ml |
| Tween | 0.1% | 100µl | |
| H2O | qsp |
| Solution “Stop” Tris NaCl Tween 0.1% pH 7.5 | cº stock | cº finale | 100ml |
| Tris Cl pH 7.5 | 1M | 0.1M | 10ml |
| NaCl | 3M | 0.1M | 3,33ml |
| Tween | 0.1% | 100µl | |
| H2O | qsp |
| moins bruits de fond | normal | Si faible expression | ||
| Solution de coloration | cº finale (µg/ml) | |||
| NBT | 337.5 | 1µl | 2µl | 4µl |
| BCIP | 175 | 3.5µl | 3.5µl | 3.5µl |
| Staining buffer | 1ml | 1ml | 1ml |
Laisser monter la coloration à 18ºC ou à 4ºC (de quelques heures à plusieurs jours)
Il est possible d’arrêter la coloration pour la nuit ou pour le We et de la reprendre ensuite. Pour cela, enlever la solution et coloration et faire un rinçage de Tris NaCl Tween 0.1% pH7.5 puis changer le bain de Tris NaCl Tween 0.1% pH 7.5 et laisser au noir à 4°C (à éviter pour les régénérats qui montent vite). Pour la reprise, faire un bain de staining buffer avant d’ajouter de la solution de coloration comme précédemment.
- Arrêt définitif de la coloration par transfert de matériel dans tube de 2 ml avec 2ml de “Stop” pH 7.5
- 5min x2 + agitation dans 2 ml de “Stop”
- Transférer le matériel dans tubes 2ml avec PBS Tween 0,1%
- 5min x3 + agitation dans PBS Tween 0,1% (ou la nuit à 4°C pour les régénérats)
- OV 4ºC + agitation dans Glycérol 87%
Solutions stock
PFA 16 %
Dissoudre 16% de poudre paraformaldehyde dans le PBS 1x en agitant et en chauffant à 65°C. La dissolution est obtenue en ajoutant progressivement du NaOH 2M jusqu’à dissolution complète. Après dissolution, attendre que la solution revienne à RT puis ajuster le pH à 7,5. Filtrer à 0,22 mm. Aliquoter dans des Falcons de 15 ml et congeler.
Glycine 20 mg/ml (x10)
Dissoudre 4 g de glycine dans 200 ml de PBS; Ajuster le pH à 7,5. Aliquoter dans des Falcons de 15 ml. Congeler.
Tampon d’hybridation TH
Pour 50 ml:
Formamide 25 ml
SSC 20x pH7.5 12.5 ml
Héparine 50 mg/ml 125 ml
Torula RNA poudre 250 mg
Tween20 50 ml
H2O qsp
Accessoires
Stock personnel de petits paniers :
Il faut : – des cônes de 1 ml à filtre
– Des petites colonnes “Spin” usagées, nettoyées
– Du rideau nylon de trame 80-100 mm
En utilisant un cutter légèrement chauffé à la flamme d’un bec Bunsen découper l’encolure et la pointe d’un cône pour obtenir un cylindre régulier. Faire de même pour les colonnes. Enfoncer le cylindre dans la colonne de façon à obtenir le fond le plus plat possible. Chauffer cette extrémité à la flamme jusqu’au premier indice de fonte et poser immédiatement sur un bout de rideau. Faire de même pour tous les petits paniers puis découper le rideau autour des paniers. Toujours avec un cutter chauffé, égaliser les bords du panier de façon à ce qu’il rentre sans effort dans un tube de 2 ml. Limer si nécessaire. Inspecter le fond des paniers à la loupe binoculaire pour vérifier qu’ils ne sont pas percés.
Tubes à fond plat
Utiliser une plaque chauffante à 250 °C. Poser une feuille d’aluminium sur la plaque et faire fondre le fond de tubes de 2 ml de façon à ce qu’il soit le plus plat possible sans que le plastique fondu déborde au delà du diamètre initial du tube.
Nettoyage des accessoires:
Les cuves et grands paniers sont lavés abondamment à l’eau et rincés à l’eau osmosée.
Les petits paniers et les tubes a font plat sont traités au NaOH 0.5M pendant la nuit avec agitation puis lavés abondamment à l’eau et rincés à l’eau osmosée.
Les tubes de lavage et d’immuno sont rincés trois fois à l’eau osmosée et mis à sécher sur la paillasse.