Biogenèse des ARNs et homéostasie du génome>> Activités de recherche et travaux

Au cours des dernières années, nos travaux ont mis en évidence plusieurs nouveaux mécanismes régulant la biogenèse des ARNm, et révélé leurs répercussions sur l’expression des gènes et la stabilité du génome, comme détaillé ci-dessous.

Une fonction pour SUMO dans le contrôle de la biogenèse des particules d’ARNm

Lorsque les particules d’ARNm (mRNPs) s’engagent dans la voie d’export sur la face nucléaire des complexes des pores nucléaires (NPCs), elles se trouvent à proximité d’Ulp1/SENP2, une enzyme de déconjugaison de SUMO qui régule les modifications post-traductionnelles par ce petit poylpeptide. Cette observation nous a amené à nous demander si les régulations par SUMOylation pouvaient moduler l’assemblage ou le transport des particules d’ARNm. Pour répondre à cette question, nous avons réalisé un crible protéomique basé sur la purification par affinité des particules d’ARNm à différents stades de leur biogenèse, à l’aide de versions étiquetées de différentes protéines de liaison aux ARN, suivie par l’analyse de la composition des complexes ainsi isolés par spectrométrie de masse. En comparant le contenu des particules d’ARNm isolées à partir de cellules de levure sauvages ou mutantes pour ULP1, nous avons ensuite pu montrer que les régulations par SUMO contrôlent le recrutement d’un nombre limité de facteurs protéiques sur les ARNm.
Parmi eux, le complexe THO, un facteur de biogenèse des particules d’ARNm, critique pour prévenir la formation de R-loops, a fait l’objet d’études plus approfondies. Nous avons notamment établi que la modification de THO par SUMOylation de sa sous-unité Hpr1 contrôle son recrutement au sein des mRNPs. Des défauts de SUMOylation du complexe THO affectent notamment son association à des ARNm induits en conditions de stress, entrainant leur dégradation par l’exosome, la principale machinerie nucléaire de dégradation des ARNs, et diminuant spécifiquement la viabilité dans de telles situations (Fig. 3; Bretes et al., 2014).
La régulation par SUMO de l’assemblage des particules d’ARNm est donc critique pour l’expression génétique en conditions de stress, complétant ainsi notre vision du rôle plus général de cette modification dans le métabolisme des ARNm. Dans ce cadre, nous avons également recensé l’ensemble des modifications par SUMO ciblant les protéines de liaison aux ARNm, et mis en évidence des règles générales quant aux conséquences de cette modification (Rouviere et al., 2013).

Des régulations coordonnées pour les ARNm codant les sous-unités de complexes multiprotéiques

Si de nombreuses activités cellulaires mettent en jeu des édifices protéiques formés de plusieurs sous-unités, les régulations contrôlant leur homéostasie restent mal connues. Pour comprendre les mécanismes qui contrôlent l’assemblage des complexes multiprotéiques, nous avons examiné un panel d’analyses génomiques décrivant l’association de différentes protéines régulatrices à leurs ARNm cibles, chez la levure. En axant notre étude sur les transcrits codant pour les sous-unités du NPC, nous avons pu mettre en évidence l’association spécifique d’une fraction d’entre eux avec Hek2, une protéine apparentée aux hnRNP E/K. De plus, nous avons pu montrer que l’activité de répression traductionnelle de ce facteur, ainsi que la dégradation par le protéasome, concourent à limiter l’accumulation et l’agrégation de versions non-assemblées des sous-unités du NPC, codées par ces ARNm. De manière frappante, la liaison d’Hek2 à ses transcrits cibles nécessite sa dé-SUMOylation par Ulp1, l’enzyme de déconjugaison de SUMO elle-même associée aux NPCs. Ainsi, dans des situations physiologiques ou mutantes associées à des défauts d’intégrité des NPCs, une réduction des niveaux actifs d’Ulp1 entraine l’accumulation d’espèces SUMOylées d’Hek2, inactives pour lier ses ARNm cibles et réprimer leur traduction (Fig.4; Rouviere et al., 2018).
Dans le modèle proposé, une enzyme de déconjugaison de SUMO et un répresseur traductionnel sont donc respectivement le senseur et l’effecteur d’un mécanisme maintenant l’intégrité de complexes multiprotéiques et prévenant l’accumulation de sous-unités non-assemblées, potentiellement toxiques. Comment des régulations similaires contribuent à la biogenèse d’autres complexes cellulaires reste désormais à déterminer.

Un nouveau rôle pour les introns : protéger les génomes eucaryotes de l’instabilité génétique associée à la transcription

Le rôle central de l’épissage des introns dans le contrôle de l’expression des génomes nous a amené à évaluer son impact sur la biogenèse des particules d’ARNm et le maintien de la stabilité génétique. Pour aborder cette question chez la levure, nous avons utilisé un crible rapporteur afin de définir les facteurs nécessaires à la biogenèse et à l’export des particules d’ARNm, selon que ceux-ci sont issus ou non d’une gène comprenant un intron (Bonnet et al., 2015; voir aussi Bonnet & Palancade, 2015). Dans ce cadre, nous avons pu montrer que la présence d’introns atténuait l’effet délétère de mutations entrainant l’accumulation de R-loops, suggérant que ces séquences pourraient s’opposer à leur génotoxicité.
Pour tester cette hypothèse, nous avons tout d’abord tiré parti de données génomiques pour analyser la présence de R-loops et de dommages à l’ADN dans les gènes de deux espèces évolutivement distantes, la levure S. cerevisiae et l’homme, et montré que ces lésions génétiques s’accumulaient préférentiellement sur les gènes dépourvus d’introns. En modifiant directement le contenu en introns de gènes modèles chez le levure, nous avons ensuite établi que l’élimination d’introns endogènes entrainait l’apparition de R-loops sur les gènes affectés, alors que l’insertion d’introns dans des gènes n’en comprenant pas naturellement atténuait la formation de ces structures ainsi que des dommages à l’ADN associés. En insérant en place d’un intron différentes séquences capables de s’épisser et/ou de s’associer à des protéines, nous avons enfin pu démontrer que c’est la liaison de protéines sur l’ARN, et non le processus d’épissage, qui s’oppose stériquement à la formation des hybrides ADN:ARN. Ces travaux permettent donc d’attribuer une nouvelle fonction aux introns dans la protection contre ces structures délétères, expliquant potentiellement leur conservation au cours de l’évolution  (Fig. 5; Bonnet et al., 2017; Palancade, 2018).

Autres contributions dans les domaines de la biogenèse des ARNm et de l’homéostasie du génome

Dans le cadre des travaux précédemment décrits, nous avons implémenté (i) des approches protéomiques pour caractériser les particules d’ARN, et (ii) des systèmes rapporteurs pour mesurer l’instabilité génétique associée aux R-loops et la réparation de l’ADN. Ces expertises spécifiques ont été exploitées pour répondre à diverses questions scientifiques dans le cadre de collaborations (Babour et al., 2016; Delaveau et al., 2016; Fritzen et al., 2016; Merhej et al., 2015).

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