Épigénome et paléogénome

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Paléogénétique, taphonomie moléculaire et domestication au néolithique.

 

Le premier volet des recherches de l'équipe paléogénétique vise à  la caractérisation de l'ADN dans des vieux os fossiles. En effet, si l'on peut analyser de petits fragments d'information génétique à  partir d'ossements fossiles relativement peu anciens (5 à  10 mille ans) avec les techniques issues de l'étude de l'ADN moderne, l'obtention de données fiables à  partir d'os fossiles vieux de 10 à  100 mille ans devient beaucoup plus aléatoire et la barrière de 100.000 ans semble pratiquement infranchissable. Les problèmes majeurs rencontrés sont dus à  la dégradation et la complexation de l'ADN et à  la présence d'inhibiteurs des réactions d'amplification. Nous avons donc cherché à  développer des méthodes d'analyse alternative à  la PCR afin de contourner les problèmes posés par les inhibiteurs de cette PCR et par l'absence de procédures spécifiques de purification adaptée au matériel fossile. L'analyse des fossiles vieux de 465.000 ans prélevés dans des conditions optimales sur le gisement de Menez-Dregan I (Finistère) où ont été trouvés les foyers parmi les plus anciens a été effectuée en utilisant l'hybridation moléculaire ce qui a permis de mettre en évidence la présence d'ADN dans ces fossiles, la plus ancienne trace d'ADN à  l'heure actuelle, d'effectuer le typage des taxons correspondants, et de démontrer la perte de ce matériel au cours des étapes de purification couramment utilisées qui sont nécessaires à  l'amplification par PCR (Geigl, 2002). Pour permettre la caractérisation physicochimique de l'ADN contenu dans ces fossiles, et pour développer de nouvelles méthodes d'analyse adaptées au matériel fossile, nous collaborons avec des spécialistes d'horizons différents. Nous utilisons la chromatographie en phase gazeuse, la spectroscopie de masse et la microscopie électronique à  balayage couplée à  des méthodes de la spectrométrie afin d'analyser la physicochimie des lipides (Geigl et al., 2004), les protéines de l'os, ainsi que l'histologie et l'architecture de l'os moderne et en développement et de l'os fossile.

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Copyright : CNRS/IJM E. M. Geigl

Le deuxième volet de nos recherches vise à  améliorer les techniques d'amplification de l'ADN à  partir de fossiles. En effet, des traces de molécules d'ADN conservées dans les ossements fossiles sont normalement analysées par l'amplification par PCR. Par contre, cette méthode est affectée négativement par les inhibiteurs présents dans les extraits fossiles et des modifications chimiques des molécules d'ADN conservées. Par conséquent, l'analyse de l'ADN souffre des difficultés de l'authentification des séquences d'ADN ancien qui souvent ne peuvent pas être distinguées de l'ADN moderne contaminant. Nous avons développé un protocole d'amplification qui rend l'analyse du matériel génétique ancien plus fiable. Pour résumer, nous utilisons la PCR quantitative en temps réel afin de déterminer la quantité optimal de l'extrait fossile permettant l'obtention d'un rendement maximum du produit PCR avec un minimum d'inhibition de la réaction (Pruvost & Geigl, 2004). Toutes les amplifications PCR sont effectuées en présence d'UTP et le clonage des produits PCR est effectué dans des souches d'E. coli qui incorporent dans l'ADN d'UTP à  la place de dTTP. Par conséquent, les contaminants potentiels par des produits d'amplifications PCR ou de clonage des produits PCR préalables sont dégradés par l'uracil-N-glycosylase (UNG) avant chaque amplification (Pruvost et al., 2005). Cette procédure UQPCR nous permet de diminuer 10 000 fois le niveau de contaminants qui auraient pu échapper au confinement physique dans lequel se déroule chaque analyse d'ADN ancien. De plus, les conditions de tampon et le traitement par l'UNG qui corrige dans l'ADN ancien les bases modifiées qui sont le résultat de la désamination du cytosine, lésion majoritaire dans l'ADN ancien, augmentent la fidélité de l'amplification. Ainsi, cette procédure nous permet d'augmenter considérablement la fiabilité de nos analyses. Les procédures développées nous permettent l'obtention de séquences d'ADN fiables à  partir de matériel ancien et fossile et est utile pour des applications dans tous les domaines d'analyse de quantités infimes d'ADN comme la paléogénétique, la criminologie, la biologie de conservation et la traçabilité.

Nous avons également établi de nouvelles procédures de prélèvements d'ossements fossiles en collaboration avec des archéozoologues afin d'augmenter le rendement de la récupération de l'ADN ancien et de réduire la contamination avec de l'ADN moderne. Nous avons formé plusieurs équipes d'archéologues internationales de prélever aseptiquement les ossements sur le terrain, de ne pas les soumettre à  des traitements paléontologiques standards (comme le lavage) et de les garder dans le sédiment dans lequel ils étaient enfouis à  température basse. Nous avons démontré récemment l'utilité de cette procédure par une analyse comparée de l'ADN ancien extrait à  partir de plusieurs ossements prélevés à  un intervalle d'environ 60 ans et originaire d'un même squelette d'un aurochs vieux de 3 200 ans. Le premier prélèvement a été effectué en 1947 en utilisant les procédures habituelles et en 2004 en utilisant la nouvelle procédure que nous avons établie. Nous avons montré une amélioration radicale de l'amplification de l'ADN ancien à  partir des ossements prélevés en 1947. En effet, nous avons obtenu 0% d'amplification à  partir des vieux prélèvements et 100% d'amplification à  partir des "nouveaux prélèvements" (Pruvost et al , sous presse). Nous poursuivons l'amélioration de ces procédures afin de pouvoir augmenter le débit.

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Copyright : CNRS/IJM E. M. Geigl

L'application de cette approche paléogénétique plus fiable nous a permis l'étude d'un grand nombre d'ossements bovins sauvages et domestiques depuis le Néolithique jusqu'au Moyen Âge dans le but d'une étude de la domestication des bœufs et d'obtenir pour la première fois des séquences d'ADN mitochondrial à  partir d'ossements de bœufs sauvages et domestiqués du Proche et Moyen Orient datés du Néolithique et de l'Âge du Bronze. L'analyse de ces séquences a montré paléogénétiquement que la domestication des bœufs avait lieu il y a environ 10 000 ans au Proche Orient. L'aurochs sauvage Bos primigenius, l'ancêtre du bœufs moderne, B. taurus, peuplait l'Europe, l'Asie et l'Afrique du Nord pendant le Pléistocène et l'Holocène avant de s'éteindre il y a 400 ans. Les détails de sa domestication sont encore obscurs, malgré la richesse en fossiles et le nombre important d'analyses génétiques et archéologiques et malgré l'importance de cet événement pour notre civilisation. L'analyse de l'ADN mitochondrial ancien conservé dans des ossements de sites archéologiques proche-orientaux et français nous a permis d'aborder les questions relatives à  l'émergence de la domestication au Néolithique sous un angle différent. Nous avons montré pour la première fois au niveau de l'ADN " fossile " que la diversité génétique des populations d'aurochs était plus importante que celle des bœufs actuels et qu'ils ont été domestiqués il y a 10 000 ans plusieurs fois dans le bassin du Haut-Euphrate au Proche-Orient. La présence d'haplotypes proche-orientaux au Néolithique sur le territoire français a démontré qu'ils ont été importés domestiqués en Europe quelques 2 000 ans plus tard au cours des migrations néolithiques à  travers la Méditerranée et le long du Danube. L'haplotype des aurochs européens étant significativement distinct de celui des bœufs domestiqués, nous avons aussi pu montrer l'existence sporadique de croisements spontanés ou souhaités par l'homme entre l'aurochs européen mâle et le bœuf domestique proche-oriental femelle.

 

Dernière modification 14/03/2011

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