Domaines chromatiniens et réplication
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Régulation du déclenchement des complexes d'initiation au cours de la phase S
Sommaire
Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, des séquences origines consensus ont été identifiées ainsi que les protéines impliquées dans leur reconnaissance. Le motif ARS (Autonomously Replicating Sequence) est reconnu par le complexe ORC (Origin Recognition Complex) qui est fortement conservé chez tous les eucaryotes supérieurs. Au cours de la phase G1 a lieu le recrutement d'autres protéines (MCM, CDT1 et CDC6) aboutissant au complexe pré-RC (Figure 1). Contrairement au complexe ORC de levure, les complexes chez l'homme et la drosophile n'ont aucune spécificité de séquence in vitro. Aucune séquence consensus n'a pu être établie à partir des origines cartographiées in vivo. Ce résultat démontre un mode de régulation plus complexe des origines de réplication chez les métazoaires (Figure 1).
Figure 1 : Liens entre initiation de la réplication et transcription
La majorité des origines de réplication est associée à des séquences cis-régulatrices de la transcription. La fixation du complexe pré-RC résulte d'une interaction directe ou indirecte (via les facteurs de transcription) avec ces éléments. Le lien avec l'état de la chromatine n'est pas évident. En effet sur 300 origines identifiées dans le laboratoire, la moitié n'est pas associée à des histones hyperacétylées.
Le but de ce projet est de comparer les origines de réplication effectivement utilisées lors de la phase S avec les sites de fixation du complexe pré-RC. Cela permettra tout d'abord de tester si tous les sites de fixation d'un complexe pré-RC sont effectivement utilisés en phase S comme origine. Si, comme il est proposé dans la littérature, de nombreux sites de fixation du complexe ORC ne sont pas des origines efficaces, nous détermineront quelles sont les caractéristiques essentielles qui distinguent un site opérationnel d'un site inactif.
Le modèle utilisé, déjà en place dans le laboratoire, sera la lignée aviaire DT40, qui présente le grand avantage d'effectuer de la recombinaison homologue à haute fréquence. Nous allons identifier les sites d'initiation de la réplication par quantification de l'abondance des petits brins naissants d'ADN (Approche par séquençage massif). D'autre part, pour identifier les sites de fixation du Pré-RC, nous allons étiqueter des protéines du complexe de pré-réplication, notamment des sous unités du complexe ORC (Orc1 et Orc2) et du complexe MCM (Mcm3 et Mcm4). Des immunoprécipiations de chromatine avec des anticorps dirigés contre ces étiquettes nous permettrons de préparer du matériel enrichi en sites de fixation du complexe pré-RC (Approche par ChIP-seq). La comparaison de ces deux ensembles de données nous permettra de déterminer si tous les complexes pré-RC donnent lieu à des événements d'initiation efficaces, générant donc des brins naissants. Si tel n'est pas le cas nous nous attacherons à déterminer ce qui distingue un complexe efficace d'un complexe inactif.
Dernière modification 14/03/2011