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Ce cours d'une durée de 2 semaines a pour but de présenter à des étudiants de M2 l'expression des gènes comme un système dynamique et modulable, que ce soit (1) par des facteurs environnementaux ou, (2) au cours du développement, par l'influence du voisinage cellulaire.
1) Le cours progresse de la compréhension des mécanismes généraux d'expression des gènes au sein du noyau vers une intégration de ces phénomènes dans une cellule eucaryote. Cette étude permet de préciser la nature des mécanismes coordonnés mis en place par la cellule pour répondre de façon rapide à des variations du milieu environnemental (variation de la température ou du pH, carences...).
2) Comme les cellules isolées, capables de modification de l'expression de leurs gènes, les cellules d'un futur organisme pluricellulaire «répondent» à des signaux externes. Cependant, ces signaux ne sont pas issus du «milieu extérieur» mais de leur voisinage cellulaire immédiat, tant aux stades précoces du développement du fait même de l'héritage maternel qu'aux stades plus tardifs pour la mise en place de structures aboutissant à un plan d'organisation donné. Le cours s'efforce donc de montrer que le développement des organismes pluricellulaires (Métazoaires) répond à un programme précis impliquant une expression différentielle et sélective de gènes - certains gènes sont inhibés, d'autres activés- cette séquence d'événements n'étant pas (ou peu) modulable par l'environnement extérieur.
Ce cours se décline en 3 blocs : «Les acteurs de l'expression des gènes», «Influence du milieu extérieur» et «Influence du voisinage cellulaire».
BLOC 1 :
LES ACTEURS DE L'EXPRESSION DES GENES
Etude de l'expression des gènes de cellules en culture
Dans un contexte cellulaire in vitro, les molécules et structures à la base de l'expression des gènes peuvent être observées de manière indirecte par l'analyse des remodelages chromatiniens.
Les objectifs sont donc :
1) de mettre en évidence que la chromatine constitue un système dynamique et que les histones, par leurs relations avec l'ADN, interviennent dans la régulation de la transcription des gènes.
2) d'analyser les conséquences de l'expression des gènes en fonction de la localisation subcellulaire et la quantité de leurs produits.
Support théorique (Cours)
Chromatine: organisation, structure et dynamique de la chromatine, mécanismes de modifications, régulations transcriptionnelles, aspects stochastiques de l'organisation moléculaire.
Protéomique : caractérisation des variations de la production de vastes ensembles de protéines (protéome), identification et analyse de protéines par spectrométrie de masse (MALDI-TOF et ESI), analyse fonctionnelle (SELDI-TOF).
Imagerie: techniques modernes d'imagerie cellulaire, vidéo-microscopie, microscopie confocale à balayage, microscopie confocale rapide (Spinning disc), microscopie multifocale multiphoton (TriMscope), transfert résonnant d'énergie par fluorescence (FRET), recouvrement de la fluorescence après photoblanchiment (FRAP), microscopie de durée de vie de fluorescence en imagerie (FLIM).
Support pratique (TPs)
1. Un gène de fusion histone H3-GFP, sous contrôle d'un promoteur inductible, constitue un outil d'analyse de l'organisation et de la dynamique de la chromatine en cellule vivante. Il permet par exemple (1) d'obtenir une cartographie nucléaire des régions transcriptionnellement actives de la chromatine (en utilisant le variant histone H3.3), (2) d'observer les modifications de cette cartographie au cours du cycle cellulaire et lors de l'activation de gènes , (3) de mesurer la dynamique de protéines nucléosomales en combinant des mesures de FRAP et de FRET entre l'histone fusionnée à la GFP et l'ADN marqué par le bromure d'éthidium ou ayant incorporé des nucléotides fluorescents, (4) de mesurer par immunoprécipitation de chromatine l'incorporation d'histones dans les gènes en cours de transcription.
2. L'analyse transcriptionnelle menée en parallèle consiste en une évaluation qualitative et quantitative des protéines exprimées après stimulation des lignées cellulaires. Ces variations sont analysées par électrophorèse bi-dimensionnelle et spectrométrie de masse.
BLOC 2 :
INFLUENCE DU MILIEU EXTERIEUR
Mise en évidence chez la levure saccharomyces cerevisiae de modulations de l'expression des gènes
Les organismes unicellulaires répondent à des variations environnementales par des modifications de l'expression de leurs gènes aboutissant dans certains cas à un changement phénotypique.
Les objectifs sont donc :
1) de mettre en évidence les différentes étapes de perception d'un changement de milieu aboutissant à une modification de l'expression des gènes.
2) de comprendre comment la régulation de l'expression des gènes constitue une réponse à ce changement.
Support théorique (Cours)
Etude dans la levure S. cerevisiae d'adaptations simultanées par régulation transcriptionnelle et modification de trafic intracellulaire. S. cerevisiae comporte un grand nombre de gènes codant pour des transporteurs de membrane plasmique et peut répondre très rapidement à des changements environnementaux par apparition ou disparition de transporteurs (de sucres ou d'acides aminés par exemple) à la surface cellulaire. Cette modulation se produit selon une double régulation: une régulation transcriptionnelle, et une régulation du trafic intracellulaire de ces transporteurs quand leur présence à la membrane plasmique n'est plus nécessaire.
Support pratique (TPs)
Un gène codant l'uracile perméase (Fur4p), fusionné avec la GFP et sous contrôle d'un promoteur inductible par le galactose sert de modèle d'étude pour suivre in vivo le trafic intracellulaire d'un transporteur de membrane plasmique. L'adressage à la membrane plasmique de l'uracile perméase ainsi que son endocytose sont très étroitement régulés. Des exemples de cette régulation sont illustrés tout au long des travaux pratiques.
BLOC 3 :
INFLUENCE DU VOISINAGE CELLULAIRE
Etude de l'expression des gènes au cours du développement d'un organisme pluricellulaire
La morphogenèse des organismes est un évènement continu dont l'information se transmet à travers les générations dès l'ovogenèse. Un large éventail d'éléments informatifs sont concernés car le processus concerne aussi bien les facteurs de transcription que des protéines impliquées dans la signalisation.
Les objectifs du cours sont:
1) de montrer, à travers l'exemple de la mise en place de l'axe dorso-ventral des amphibiens, et de l'axe antéro-postérieur et de la latéralité chez la souris, les différentes stratégies qui sont utilisées chez les vertébrés pour établir les premières hétérogénéités dans l'expression génique - hétérogénéités qui sont à l'origine des différenciations tissulaires et morphologiques de l'embryon.
2) d'aborder la notion d'établissement de la polarité de l'embryon.
3) d'appréhender la diversité de représentation d'une voie de signalisation.
4) d'appréhender la notion de réseau de régulation par les connexions physiques reliant entre elles les voies de signalisation.
Exemple 1: Rôle de l'information maternelle dans le contrôle de l'expression des gènes au cours de l'établissement de l'axe dorso-ventral chez l'«amphibien»
Support théorique (Cours)
Etude du rôle du facteur de transcription VegT (Vegetal cortex T-box protein) dans les premières transcriptions zygotiques de l'amphibien.
Analyse des cibles de la protéine Nodal et de l'induction du mésoderme.
Présentation de la ß-caténine, un élément primordial de la polarité de l'embryon.
Support pratique (TPs)
Distinction entre l'information maternelle et l'information zygotique à l'aide de l'expression de la GFP dans des embryons de Xenopus laevis. Le gène codant la GFP est microinjecté soit sous forme d'ARNm soit sous forme d'ADNc sous le contrôle du promoteur CMV. La période d'expression des protéines est suivie au cours de différents stades du développement embryonnaire par la fluorescence de la GFP.
Exemple 2: Régulation de l'expression des gènes au cours du développement de la souris: exemple du gène Nodal
Support théorique (Cours)
Historique de l'étude du gène Nodal chez la souris : mise en évidence des régulateurs de l'expression de ce gène comme exemple d'une régulation fine d'un gène du développement.
Support pratique (TPs)
Observation d'embryons de souris transgéniques, âgés de 6 à 8 jours post-coïtum, exprimant le gène LacZ sous le contrôle de différents régulateurs de la transcription du gène Nodal. Détermination du transgène inséré en fonction du profil d'expression observé.
Dernière modification 23/11/2012